渭南细胞-转染-英瀚斯(推荐商家)

细胞增殖检测

     本公司应用MTT比色法， 检测细胞存活和生长。其检测原理为huo细胞内线粒体中的琥珀酸脱氢酶能催化外源性无色的MTT形成蓝色的结晶Formazan，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二jia基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的Formazan，用酶联mian疫检测仪在一定波长处测定其光吸收值，可间接反映huo细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

     该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿liu药wu筛选、细胞毒性试验、以及肿liu放she敏感性测定等。服务内容      1. 细胞接种：收到客户细胞后，细胞系，我们会用细胞计数板计数细胞，得出细胞悬液浓度。计算出应稀释的倍数，按MTT试剂盒要求在96孔板内接种 相应浓度的细胞悬液；

     2. 细胞培养：然后在无菌恒温细胞培养箱内培养接种好的96孔细胞培养板，并实时观察细胞状态；  

     3. yao物处理并呈色：按不同浓度梯度加入yao物作用细胞；

     4. 溶解，比色：加入MTT检测试剂，按操作要求孵育相应时间，在mei标仪内检测对照组和实验组的吸光值。并处理数据得出比色结果。

细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡

流式细胞术检测细胞周期：

细胞周期：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期：当DNA成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。

PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-PI染色-流式细胞仪检测。

细胞凋亡：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在之前，检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，流式细胞检测，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。

一般流程：细胞收集-PI-AnnexinV标记-流式细胞仪检测。

结果示例：

                                   图 A 细胞周期检测图；B 细胞凋亡检测图

大鼠gu髓间充质gan细胞的分离

操作方法

(1 )取SD大鼠( 2周龄)，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉， PBS溶液冲洗两遍。

(3 )从中间剪断股骨和胫骨，用2ml无菌注she器吸取DMEM/F 12溶液冲出gu髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，渭南细胞，用PBS重悬细胞。

(4 )缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面，保持二者分层界面。

(5 ) 2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨sui基质细胞层(白色浑浊状)， PBS洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青链mei素的DMEM/F 12以106/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中， 置37°C、5%CO2恒温培养箱中培养。

( 7 ) 24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况)，转染，PBS冲洗2-3次去除末贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，-般10d细胞生长融合。

(8 )经0.25%胰酶消化，1 : 2传代，其后一般3-5d传代1次，选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。