动物实验室-徐州动物实验-南京英瀚斯

ROS也就是活性氧（reactive oxygen species，ROS）指来源于氧的自由基和非自由基。ROS在细胞生命，应激和si亡中具介导作用，并且不同浓度的ROS在其中起着截然不同的作用，从而导致细胞命运的不同。因此对ROS的浓度或相对水平进行可靠的测量非常有必要。

实验仪器和材料

细胞培养基

胎牛xue清

青mei素/链mei素

胰酶

PBS

DMSO

活性氧（ROS）试剂盒

血球计数板

CO2培养箱

倒置荧光显微镜

1、细胞传代培养：当细胞长至80-90%时，去除培养基，加入PBS洗1-2次，去除PBS后，加入1ml胰酶消化1-3min后，加入3ml完全培养基中和胰酶终止消化，实验动物模型公司，将消化的细胞转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min。倒掉上清后，加入3ml培养基重悬细胞，1:3传代至培养皿中培养。

2、将长到培养皿80%-90%的内皮细胞用胰酶消化下来，1000rpm离心，去除上清，加入完全培养基重悬细胞，将细胞分别种在6孔板中，每孔种1×106个细胞。3、待细胞贴壁后，使用不同的含药xue清的培养基培养细胞。3、待细胞贴壁后，使用不同的含药xue清的培养基培养细胞。4、48h后，加入DCFH-DA于培养基中，稀释倍数为1:1000。5、孵育1h后，直接将细胞置于荧光显微镜下拍照。

实验结果

2强迫运动睡眠剥夺法

此类睡眠剥夺方法形式多样，在脑电监护情况下可行全部的睡眠剥夺和选择性的睡眠剥夺。其共同特点是通过动力装置迫使大鼠不停地运动，从而达到睡眠剥夺的目的。此类方法的优点是睡眠剥夺效果明显，睡眠剥夺的时间及强度易于掌握，重复性好，无须实验人员随时观察实验情况，减轻了实验人员工作强度。缺点是长时间运动引起机体的一系列应激反应可能干扰睡眠剥夺的实验结果，现选取其中两种有代表意义的方法介绍如下

2.1水平转盘睡眠剥夺法

此方法应用广泛，动物实验外包，于 1983 年先应用在睡眠剥夺实验中，实验装置由一个电脑控制台、一个水平转盘及两个开放的长方形有机玻璃缸组成，转盘直径为 46 cm，在电脑控制下可以按顺时针逆时针方向随机水平转动! 两只有机玻璃缸的尺寸均为长60 cm ，宽20.5 cm，高 60 cm 。在距离缸底 5 cm 处的缸侧壁开有一条缝隙，使转盘的一半能分别从缝隙伸入两只玻璃缸中并能随意转动。缸底留置水约 2 cm 深，转盘离水面约3 cm 实验前1周将睡眠剥夺大鼠头颈部植入微电极" 并将微电极与电脑控制台相连，将大鼠放在转盘上适应环境1周，每天约1 h让大鼠习惯在转盘上活动，动物实验室，进水，进食等。实验时将实验组的大鼠及对照组的大鼠分别置于两只缸中的转盘上，当电脑通过微电极监测到实验组大鼠进入慢波或快波睡眠的脑电信号后，立即发出指令使转盘转动 6 s(6 s内转动 1/3 圈)，当大鼠被转到玻璃缸壁时，因被玻璃缸壁挡住而可能掉入水中，每次在实验组睡眠剥夺大鼠进入睡眠时转盘即转动 6 s，徐州动物实验，方向随机，转盘转动时两只大鼠均被动地随着转盘移动。此方法一次只剥夺一只大鼠睡眠，当实验组的睡眠剥夺大鼠在活动、进水、进食时转盘并不转动而此时对照组的大鼠则可趁机睡觉以弥补被剥夺的睡眠。此方法中睡眠剥夺组大鼠与对照组大鼠条件极其相似，因而可减少因实验条件不同而所致的应激反应。

敲低效果验证方法：

RT-PCR

检测mRNA，是否仍存在靶 mRNA？或是否敲低成功？

这种方法非常灵敏，但无法准确预测蛋白质水平。

蛋白质印迹实验

使用抗ti来检测样品中的靶蛋白表达以及多种相关蛋白质表达，从而观察靶蛋白敲除对其它蛋白质的影响。

免yi细胞化学法

可检测是否存在敲低蛋白。

其优势在于利用双重染色法，可同时检查敲除对其它蛋白质表达的影响以及其它蛋白质在细胞中的位置。