阻断内源性过氧化物酶：滴加3%1甲1醇-H2O2，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。
杂交：倾去预杂交液，滴加含探针has-circ-ST6GALNAC6 probe 杂交液，浓度6ng/ul，恒温箱37度杂交过夜。
杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。
滴加封闭液：滴加封闭血1清（正常兔血1清），室温30min。
滴加鼠抗地1高辛标记过氧化物酶（anti-DIG-HRP）：倾去封闭液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育50min，后PBS洗3次×5min。
原位杂交天
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的PBST溶液，放置5分钟。
2） 置换成30%的PBST溶液，放置5分钟
3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次
4） 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）
1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。
2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。
3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。
4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
2. 预杂交
1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。
2）用等体积的HYB+取代HYB－。
3）60℃水浴，预杂交4小时以上。
3. 杂交
1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..
2）60℃ 温浴过夜。注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。
原位杂交的应用范围：
①细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究；
②感1染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人类乳1头状瘤1病毒和巨细胞病毒DNA的检测；
③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；
④基因在染色体上的定位；
⑤检测染色体的变化，植物组织RNA原位杂交技术服务，如染色体数量异常和染色体易位等；
⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿1瘤的诊断和生物学剂量测定等。
植物组织RNA原位杂交技术服务-科锐诺生物(在线咨询)由武汉科锐诺生物科技有限公司提供。武汉科锐诺生物科技有限公司坚持“以人为本”的企业理念，拥有一支高素质的员工队伍，力求提供更好的产品和服务回馈社会，并欢迎广大新老客户光临惠顾，真诚合作、共创美好未来。科锐诺——您可信赖的朋友，公司地址：湖北省武汉市江夏区神墩四路666号武汉国英种子A栋1楼，联系人：王经理。