






DNA 探针为原位杂交提供较高的灵敏度。与RNA探针相比,DNA探针与靶mRNA 分子的杂交强度较弱,因此在杂交后的洗涤中不应使用甲醛。
探针特异性至关重要。如果已知细胞中mRNA或DNA的确切核苷酸序列,则可据此设计高度的互补探针。如果超过 5% 的碱基对不互补,那么探针只能与靶序列发生轻度杂交。这意味着,探针更容易在洗涤和检测步骤中被洗去,可能无法正确检测。
原位杂交技术方法大致可分为:1.杂交前准备,包括固定、取材、玻片和组织的处理,如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等;2.杂交;3.杂交后处理;4.显示(visualization):包括性自显影和非性标记的显色。固定原位杂交组织化学技术在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面:保持细胞结构,限度地保持细胞内DNA或RNA的水平;使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的,mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA却绝然不同,非常容易被降解。因此,对于DNA的定位来说,固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反,在RNA的定位上,如果要使RNA的降解减少到低限度,那么,不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要,而且取材后应尽快予以冷冻或固定。

原位杂交第二天
1.
1)将探针回收,放于-20C保存(通常探针可重复使用十次左右)。
2)加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升,荧光原位杂交,60℃,放置30分钟,重复一次。
3)置换2XSSCT1ml,60℃,放置15分钟。
4)置换0.2XSSCT1ml,60℃,放置30分钟,重复一次。
2.
1)用MABT洗两次,每次五分钟,放在摇床轻轻摇动。
2)室温下加1ml 1:2:7溶液,时间为一小时。
3)按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶连,4C 冰箱过夜。
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