世联博研科技有限公司-斑点酶联免疫生产厂家-斑点酶联免疫

斑点酶联免疫（ELISPOT）的原理是什么呢

（一）原理：细胞受到刺激后局部产生细胞因子，被PVDF膜上特异性单clone Antibody捕获。细胞分解后，再与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF膜出现“紫色”的斑点为阳性反应。

（二）ELISPOT与ELISA的区别

1.ELISA通过显色反应，在Microplate reader上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。

2.ELISPOT通过显色反应，斑点酶联免疫，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下或通过仪器对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。

3.由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万～30万个细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。

4.捕获Antibody为高亲和力、高特异性和低内toxin McAb，在研究者以刺激剂activation细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

为什么选择斑点酶联免疫？

高灵敏度：20万-30万中1个阳性细胞检测率；

直观、可信度高：单细胞水平检测，一个阳性细胞一个斑点，斑点数量代表分泌细胞因子的细胞数量多少，斑点酶联免疫多少钱，斑点大小代表该细胞分泌细胞因子水平的多少；

高通量：一块ELISPOT板可作96test，科研工作者每天可检测数百个样品，只需少量细胞如45mL血液就足以用于测试600种不同抗原/肽类物质的反应；

Living cells功能检测：检测到的细胞因子不是已存在的，而是在检测过程中，被加入的刺激物刺激而分泌出来的；

临床实验适用：经过冻存复苏的细胞并不丧失免疫功能，对临床试验非常重要，Before and after treatment的样本可以进行平行测试，结果可以重复；如果试验涉及多个临床机构，血样可冻存、运输到实验室进行检测。

斑点酶联免疫原理

将细胞置于包被有特异性Antibody的96孔板中培养，在有刺激的条件下，细胞分泌的细胞因子或免疫球蛋白会被包被Antibody捕获。移除细胞后，被capture的细胞因子可进一步使用生物素标记的二抗来标识，斑点酶联免疫生产厂家，其后再与酶标记的亲和素作用，并加入底物使其呈色，斑点酶联免疫供应商，有反应作用的细胞会留下直径大小不等的stained spots。

1. 加入细胞到含有（或不含）刺激物中培养；

2. 阳性细胞开始分泌细胞因子，细胞因子就近被包被Antibody捕获；

3. 移出细胞，清洗板子，加入生物素标记的检测Antibody，形成“Antibody-抗原-Antibody”夹心结构；

4. 为了观察膜上斑点的形成，加入酶标记的亲和素；

5. 加入显色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；

6. 斑点计数（可用bioreader自动读板仪计数），数据处理，结果分析。