酶联免疫斑点技术（Enzyme Linked Immunospot Assay，简称ELISPOT）
是细胞免疫学研究中更敏感的检测方法，可以在单细胞水平对Antibody分泌细胞(ASC)及细胞因子(CK)分泌细胞进行检测，比ELISA和有限稀释法等具有更髙的灵敏性，能从20万-30万细胞中检岀1个分泌该蛋白的细胞。并且该方法能够对抗原刺激后的Living cells进行功能性检测，具有较髙的特异性、直观可信度髙，并且易操作，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中，在国内外免疫学界获得了广泛的应用。
ELISPOT实验步骤
淋巴细胞受到抗原刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被ELISPOT板底PVDF膜上(预包被的)的特异性单抗捕获。去除细胞后，斑点酶联免疫，BEI捕获的细胞因子与生物素标记的单抗结合，其后再与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的亲和素结合。加底物显色后，PVDF膜上出现紫色或红褐色的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过酶联免疫斑点分析仪（ELISPOT Reader）对斑点的进行自动计数和分析。
斑点酶联免疫实验步骤与原理示意 （示意图如下）
大致原理上分为如下7个步骤，详情已具体产品说明书为准
Step.1 包被：将单clone捕获Antibody添加到乙醇处理的PVDF膜板上
Step.2 细胞孵育：在有刺激的情况下加入细胞，孵育，细胞分泌细胞因子
Step.3 捕获分泌物：activation后的细胞，分泌的细胞因子被周围的Antibody结合捕获
Step.4 检测Antibody：去除细胞，清洗平板，加入生物素化的检测Antibody
Step.5 链霉亲和素-酶偶联物：加入链霉亲和素偶联物，保证后续在膜上形成斑点
Step.6 加反应底物：当酶催化时，显色底物形成不溶性沉淀
Step.7 结果分析：在自动点阅读器中对结果进行分析。每个斑点对应一个分析物分泌细胞
斑点酶联免疫（ELISPOT）的原理是什么呢
（一）原理：细胞受到刺激后局部产生细胞因子，被PVDF膜上特异性单clone Antibody捕获。细胞分解后，再与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF膜出现“紫色”的斑点为阳性反应。
（二）ELISPOT与ELISA的区别
1.ELISA通过显色反应，在Microplate reader上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
2.ELISPOT通过显色反应，斑点酶联免疫生产厂家，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下或通过仪器对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，斑点酶联免疫哪家好，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
3.由于是单细胞水平检测，斑点酶联免疫价格，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万～30万个细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。
4.捕获Antibody为高亲和力、高特异性和低内toxin McAb，在研究者以刺激剂activation细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
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