将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟，迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。
杂交结束后，染色体原位杂交，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗 一次，同时应避免膜干涸。
68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次，每次1-1.5小时。此时已可进行自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。
原位杂交第三天
1） 用1ml含10％热灭清的MABT溶液置换溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，后用1mlMABT溶液置换，25分钟。
2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。
3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，植物原位杂交，加上300ul BM Purple AP Substrate(底物，原位杂交，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。
4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色
5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，荧光原位杂交，用PBST洗两三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照。
6）4C冰箱保存。
原位杂交技术是一种在生物组织或细胞中定位DNA片段或RNA序列的重要生物技术，具有广泛的应用前景。该技术在医学、农业和工业等领域都有广泛的应用，可以帮助人们深入理解基因表达和遗传特征，为疾病的诊断和、品种的鉴定和遗传育种以及产品安全性和稳定性的检测提供有效手段。随着科技的不断发展，原位杂交技术的应用前景将更加广阔，为生命科学和医学等领域的研究提供更多可能性。
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