分子病理技术服务-科锐诺(推荐商家)

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子（reporter molecule）结合，杂交后再通过细胞化学过程连接上荧光染料[1，2].FISH的基本原理是将DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术.

原位杂交杂交液注意事项：

       （1）杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血1清白蛋白及载体DNA或RNA等。

       （2）杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加，可以减低探针与组织标本之间的静电结合。甲酰胺可使Tm降低，杂交液中含每1%的甲酰胺可分别使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的杂交温度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。，所以杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的（尤其对双链核酸探针）。

       在杂交液中加入牛血1清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。

滴加FITC-TSA：滴加FITC-TSA试剂，避光室温反应5min。后TBST洗3次×10min，PBS洗1次×5min。

DAPI复染核：切片滴加DAPI染液，分子病理技术服务，避光孵育8min，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片1剂封片。

镜检拍照：切片于尼康正置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FAM(488)绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm，发红光。）

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